生物大分子的结构与功能

概述

生物大分子——结构生物化学

目录：

• 蛋白质的结构与功能
• 核酸的结构与功能
• 酶与酶促反应

生物大分子的结构特点：

• 由基本结构单位组成（氨基酸 / 核苷酸 / 单糖）
• 按一定顺序排列（有序结构）
• 结构复杂又精密（一级结构、空间结构）

一、蛋白质的结构与功能

蛋白质是生命物质的基础：分布广、含量高——对生命重要

蛋白质具有重要的生物学功能：

蛋白质可氧化分解供能（较少）

1. 分子组成：元素组成、基本结构单位

基本结构单位：氨基酸

• 自然界中 300 多种
• 组成人体蛋白质的有 20（多）种 α-氨基酸

氨基酸结构：H₃N⁺-CHR-COO⁻；

氨基酸的分类：

蛋白质翻译后修饰：磷酸化、甲基化、乙酰化、丁酰化、乳酸化

氨基酸的理化性质：

1. 两性解离：等电点 pI（isoelectric point）

2. 紫外吸收：芳香族氨基酸的共轭 π 键，对 230～300 nm 光有吸收；测量 280 nm 吸光度

3. 茚三酮反应：氨基酸与其水合物供热，生成蓝紫色物质（570 nm 比色），可定性/定量

氨基酸的成肽反应：

羧脱羟基、氨去氢 → 肽键，肽链

• 肽链方向：氨基 N 端到羧基 C 端
• 寡肽 ≤ 20 个氨基酸残基 / 多肽

2. 蛋白质的分子结构：各级结构特点

一级结构：蛋白质分子所含氨基酸残基的排列顺序（描述连接肽链中氨基酸的肽键与二硫键等化学键）

二级结构：多肽链骨架（主链）中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象

• 主要形式：α 螺旋、β 折叠、β 转角、Ω 环
• 结构基础：肽单元 peptide unit（肽键的 C、N 与两个 Cα、一个 O、一个 H 处于同一平面）
• 一个蛋白质分子可同时存在四种形式的二级结构

• 模体 motif：蛋白质分子中 2 个或 2 个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个规则的二级结构的组合

三级结构：整条肽链中所有氨基酸残基的相对空间位置，即一条多肽中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链

结构域 domain：具有三级结构的多肽链的一部分区域，具有特定功能

只有一条肽链组成的蛋白质，三级结构是其最高的结构形式

三级结构的特点：

• 肽链进一步盘曲折叠，长度大大缩短，呈棒状、纤维状或球状；
• 三级结构的稳定性主要靠次级键（疏水键、离子键、氢键）维持，尤其是疏水键；
• 疏水基团多位于分子内部，亲水基团多位于分子表面；
• 分子表面或某些部位形成功能区

四级结构：包含多条肽链的蛋白质分子，其肽链之间通过次级键相连所形成的空间结构；具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基 subunit

蛋白质分类

3. 蛋白质结构与功能的关系：举例说明

蛋白质的一级结构与功能的关系：

蛋白质的空间结构与功能的关系：

1. 蛋白质行使其功能依赖特定的空间结构
2. 空间结构相似，功能相似
3. 空间结构改变，功能相应改变
4. 蛋白质构象改变是某些疾病的发生机制

别构效应allosteric effect：蛋白质分子的特定部位与小分子化合物结合后，蛋白质的空间构象发生改变，从而导致其生物学活性的变化。

协同效应cooperativity：含多个亚基的蛋白质，其中一个亚基与配体结合后，能影响其他亚基与配体的结合能力。

4. 蛋白质的理化性质：应用

1. 蛋白质的两性解离：等电点，电泳分离
2. 蛋白质的紫外吸收：色氨酸、酪氨酸共轭双键；280nm
3. 蛋白质的呈色反应：茚三酮反应；双缩脲反应
4. 蛋白质的胶体性质：蛋白质胶体的稳定因素（颗粒表面电荷、水化膜）带电稳定；
5. 蛋白质变性denaturation：在某些理化因素作用下，蛋白质的特定空间构象被破坏，导致其理化性质改变和生物学活性丧失；
   • 复性renaturation：蛋白质变性程度较轻时，将变性因素去除后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。

5. 蛋白质的分离纯化常用技术：原理

一、透析及超滤法（根据分子量）

• 透析dialysis：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
• 超滤法ultrafiltration：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过超滤膜，小分子滤出，大分子留在膜内。（纯化、浓缩）

二、沉淀precipitation

• 盐析(salt precipitation)：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
• 有机溶剂沉淀：丙酮、乙醇等有机溶剂，可破坏蛋白质的水化膜，在0～4℃低温下，使蛋白质沉淀。环境温度高时，有机溶剂可促使蛋白质变性。
• 免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）：免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）

三、电泳electrophoresis

• 利用蛋白质的两性解离性质，使其带电荷后在电场中泳动。不同的蛋白质，因分子大小不同，所带电荷不同，因而泳动速度不同。

四、层析chromatography

1. 凝胶过滤gel filtration，分子筛：凝胶过滤gel filtration，分子筛
2. 离子交换ion- exchange chromatography：
   • 根据蛋白质电荷量及性质不同来分离
   • 阳离子交换剂：CM-纤维素
   • 阴离子交换剂：DEAE-纤维素
3. 亲和层析affinity chromatography：3. 亲和层析affinity chromatography

五、超速离心ultracentrifugation

• 根据蛋白质的分子量与形状分离；
• 沉降系数（sedimentation coefficient）：颗粒在单位离心力场中的移动速度，用“S”表示。

二、核酸的结构与功能

核酸的发现与研究简史：

1868. 米歇尔分离出核素（核蛋白）
1869. Frederick Griffith发现转化因子（肺炎双球菌）
1870. Olswald Avery首次证明DNA是遗传物质
1871. Hershey和Chase用同位素标记法进行噬菌体实验，进一步证明DNA是遗传的物质基础

首次证明：创新性

进一步证明：重要/.

大胆假设、小心求证。——胡适《跟着自己的兴趣走》

分子生物学时代；

组学时代：基因/转录/蛋白质/代谢组etc

0. 核酸的类型

1. 核酸的分子组成（元素组成、基本结构单位

• 核酸的元素组成：C，H，O，N， P（9% ~ 10%，特征）

• 核酸的基本单位：核苷酸（碱基、戊糖、磷酸基团）

  1. 碱基；碱基互补配对：A=T/U；C≡G
     • 碱基的结构特征：含氮的杂环化合物；含共轭双键，260nm处有紫外吸收峰（A260）（紫外分光光度法定量DNA）

  name	kind	structure
  嘌呤purine	腺嘌呤A 鸟嘌呤G
  嘧啶pyrimidine	胸腺嘧啶T 胞嘧啶C 尿嘧啶U

  2. 核糖：戊糖pentose；2'羟基脱氧。
  3. 核苷nucleoside：糖苷键嘌呤N9C1'；嘧啶N1C1'
  4. 核苷酸nucleotide：NMP/dNMP；5'-磷酯键；
     • M for Monophosphate，单磷酸基团

体内重要的游离核苷酸：

1. 多磷酸核苷酸：(d)NDP/NTP； > D: Diphosphate T: Triphosphate
   • 能量货币（ATP）
   • 参与合成代谢（UTP for 糖原，GTP for 蛋白质，CTP for 磷脂）
   • 合成核酸的原料（NTP for RNA，dNTP for DNA）
2. 环化核苷酸：cNMP，3',5'-磷酸二酯
   • 传递信号；第二信使（第一激素
   • cGAMP：两个磷酸外二酯
3. 辅酶、核苷酸衍生物
   • 辅酶I（NAD+）、辅酶II（NADP+）、辅酶A（CoA-SH）均含腺苷酸（AMP）；黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）

2. DNA的分子结构

1. 脱氧核苷酸的连接方式：3',5'-磷酸二酯键

   • 末端：5'末端（磷酸）、3'末端（羟基）；
   • 方向：5'末端-3'末端；

2. DNA的一级结构：脱氧核糖核苷酸的排列顺序

   • i.e.碱基序列；基本单位dNMP；eg. 5' A G C T 3'

3. DNA的空间结构

   • DNA的二级结构：双螺旋结构模型；wilkins
   • 
   1. 双链反向平行（一条链5′→3′，另一条链3′→5′），围绕中心轴呈右手双螺旋。磷酸、戊糖为骨架，碱基向内。
   2. 互补双链的碱基以氢键相连，A＝T, G C；每个碱基对处于同一平面，碱基平面垂直于中心轴。
   3. 互补双链的碱基以氢键相连，A＝T, G C；每个碱基对处于同一平面，碱基平面垂直于中心轴。
   4. 在双螺旋的表面形成大沟（major groove)和小沟(minor groove),二者交替出现，是蛋白质－DNA相互作用的基础

   5. 稳定双螺旋结构的作用力：

      1）氢键	维持 DNA 双链横向稳定性
      2）碱基堆积力	维持双链纵向稳定性（主要）

   • DNA的三链结构/四链结构（G四链体）

   • DNA的三级结构：DNA双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象（超螺旋supercoil）:

     正超螺旋positive supercoil	DNA双螺旋过度缠绕
     负超螺旋negative supercoil	DNA双螺旋缠绕不足

     • 闭合环状结构：原核生物DNA、线粒体DNA
     • 核小体nucleosome、染色质chromatin

       • DNA结构的解析是中心法则提出的重要依据

       • 染色体外DNA（ecDNA）与肿瘤的发生发展

3. RNA的分子结构

RNA的结构特点：

1. 碱基组成：A、G、C、U （A＝U/G≡C）；
2. 稀有碱基较多（tRNA）；
3. 多为单链结构，局部可形成双链；
4. 稳定性较差，易水解。

RNA的分类：

RNA的一般结构：

• RNA的一级结构：核糖核苷酸的排列顺序；基本单位种类、连接方式、方向性；
• RNA的二级结构：茎环、发卡
• RNA的三级结构：二级结构进一步盘曲

1. 核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)

   • 核糖体的组成成分, 其种类和大小用S(沉降系数)表示
   • 含量最多（占RNA总重量的80%以上）
   • 多种蛋白质结合成核糖体（ribosome），是蛋白质生物合成的场所

   

2. 转运RNA(transfer RNA, tRNA)

   • tRNA的功能：转运氨基酸至蛋白质合成场所
   • 含较多的的稀有碱基(如DHU/mG/mA等,约10%~20%)
   • 种类较多，转运氨基酸具有特异性
   • 3’端为CCA-OH结构，此处与氨基酸相连
   • 二级结构为三叶草形；三级结构为倒 “L” 形

   

3. 信使RNA(messenger RNA, mRNA)

   • mRNA的功能：合成蛋白质的模板（含密码子）
   • 前体：核内不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)
   • 5’帽：m7GpppN：m7G5'-ppp-N5'磷酸二酯键
   • 3’尾：polyA
   • 编码区、非编码区

   

核酶（ribozyme）:具有生物催化功能的RNA分子、生物催化剂

microRNA：调控性非编码RNA，大小约22个核苷酸， 在转录后水平调节基因表达

其他组成性非编码RNA
 - 催化小RNA（核酶，ribozyme）
 - 核仁小RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）
 - 核小RNA（small nuclear RNA, snRNA）
 - 胞质小RNA（small cytoplasmic RNA, scRNA）

调控性非编码RNA
 - 非编码小RNA（small non-coding RNA, sncRNA）
 - 长非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）
 - 环状RNA（circular RNA, circRNA）

调控性非编码RNA的生物学意义越来越被关注

核酸的理化性质和应用

1. 核酸的酸碱性质：
   • 核酸通常显酸性，在中性或偏碱性条件下带负电荷
   • 电泳：由负极向正极泳动
   • 沉淀：盐溶液中金属离子中和负电荷
2. 核酸的高分子性质（生物大分子）
   • 具有一定黏度（DNA > RNA）
   • 不同种类的核酸分子其分子量不同，形状不同
   • 分离：电泳、凝胶过滤、超速离心
3. 核酸的紫外吸收（ UV absorption）
   • 核酸分子中的碱基都有共轭双键，
   • 具有紫外吸收性质，吸收峰在260nm,
   • 可用于核酸的定量
4. DNA的变性、复性与杂交
   • DNA变性 (denaturation)：
     • 在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间氢键断裂，DNA双螺旋打开，变为单链。
   • 变性因素：加热（热变性）、酸、碱、有机溶剂
   • 理化性质改变：
     • 粘度降低、沉降速度增加、增色效应(A260增加
     • 熔解温度（melting temperature, Tm）DNA加热变性时，增色效应达到一半时的解链温度。
   • DNA复性（退火，annealing）：变性DNA在适当条件下，两条互补链重新恢复天然双螺旋结构的现象。
   • 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)：
     • 将不同的DNA单链分子或DNA、RNA分子混合，若二者序列完全互补或部分互补，可形成杂合双链分子。
     • 荧光原位杂交（FISH）

Southern blot（DNA-DNA杂交）——DNA含量的检测

Northern blot （DNA-RNA杂交）——RNA含量的检测

Western blot ? 抗原抗体杂交——蛋白质的检测

酶与酶促反应 enzyme

1. 酶的概述

本质：催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合物，

功能：是生物催化剂

特点：具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。

化学本质：蛋白质或核酸

研究简史：发酵fermentation现象，机制：

巴斯德Pasteur：活细胞；Buchner布赫纳《无细胞的发酵》

核酶ribozyme：具有生物催化功能的RNA分子，1989

酶的重要性：

• 体内代谢反应必不可少：Metabolism；糖原合成过程
• 酶与疾病的关系密切：医学研究的主要内容同上
• 酶与医学研究的关系密切：医学研究的主要内容同上

酶的作用特点：

2. 酶的分子结构

酶的化学本质：蛋白质或核酸

酶的分类：

• 按结构与功能

  name	explain
  单体monomeric酶	多条多肽链
  寡聚oligomeric酶	多条多肽链
  多功能multifunctional酶	eg乙酰CoA羧化酶
  多酶multienzyme复合物	含多个酶，丙酮酸脱氢酶复合物

• 按分子组成：

  name	explain
  单纯simple酶	仅含蛋白质组分，eg蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、核糖核酸酶
  结合conjugated酶	酶蛋白apoenzyme/apoprotein+辅因子cofactor，全酶holoenzyme

  辅因子：无机离子、有机小分子（辅酶coenzyme）

  辅基prosthetic group：与酶蛋白结合紧密的cofactor

酶的活性中心active center/site：酶分子中能与底物特异性结合，并催化底物转变为产物的具有特定三维结构的区域。

必需基团essential group：酶分子中与酶活性密切相关的基团。

• 活性中心内：催化基团/结合基团
• 活性中心外：维持酶的空间构象

同工酶isoenzyme/isozyme：催化相同的化学反应，但分子结构、理化性质和免疫学性质不同的一组酶。

• eg：丙酮酸<—LDH—>乳酸

  Type	Composition	Location
  LDH1	HHHH	心脏和红细胞
  LDH2	HHHM	心脏和红细胞
  LDH3	HHMM	脑和肾
  LDH4	HMMM	骨骼肌和肝
  LDH5	MMMM	骨骼肌和肝

  • 心肌中LDH1含量多，LDH1对乳酸的亲和力较高，因此主要催化乳酸转变为丙酮酸，再进一步氧化分解，为心肌提供能量。（产能多）
  • 骨骼肌中LDH5含量高，LDH5对丙酮酸的亲和力较高，因此主要催化丙酮酸转变为乳酸，以促进糖酵解的进行。（产能快）
  • 意义：不同组织或细胞有不同的代谢特点，以适应不同的需求。
  • 临床应用：同工酶谱

3. 酶促反应动力学

酶促反应动力学 enzyme kinetics：研究各种因素对酶促反应速度的影响及其反应规律

影响因素：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂

酶促反应速度：一般指反应初速度，反映酶促反应速度的大小

1. 底物substrate浓度对反应速度的影响
   1. 底物浓度较低，反应速度与底物浓度成正比
   2. 底物浓度增高，反应速度不再正比增加
   3. 底物浓度较高，反应速度不再增加
      1. 米-曼氏方程\(V = \frac{V_{max}*[S]}{K_m+[S]}\)
      2. \(K_m\)：米氏常数；意义：酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度；酶的特征性常数；可以表示酶与底物的亲和力
      3. 求\(K_m\)与\(V_{max}\)：双倒数作图\(\frac{1}{V} = \frac{K_m}{V_{max}} * \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\) - Km小、亲和力大；Km大，亲和力小 - 用途：根据Km判断酶的最适底物、可根据Km判断代谢途径的关键酶
2. 酶浓度对反应速度的影响
   • 当底物浓度>>酶浓度时，酶饱和、反应速度与酶浓度成正比
   • 酶活性：指酶催化化学反应的能力；单位时间内底物的消耗或产物的生成量表示；IU/U（International Unit）
3. pH对反应速度的影响：最适pH
4. 温度对反应速度的影响：最适温度Optimum Temperature
   • 恒温动物37～40°C
   • Taq DNA聚合酶 70～75°C，可耐受100°C高温；
   • 亚低温治疗、目标温度管理，将体温降至32～34°C 72h以上；减慢组织细胞代谢速率，提高机体对氧气和营养物质缺乏的耐受性
   • 低温存贮酶制剂
5. 激活剂对反应速度的影响
   • 酶的激活剂activator：使酶由无活性变为有活性，或使酶活性增加的物质；多数激活剂为金属离子（镁离子、钾离子、锰离子etc）有些是小分子化合物（如胆汁酸盐）
6. 抑制剂对反应速度的影响（*）
   • 酶的抑制剂inhibitor：使酶的催化活性下降或消失，但不引起酶蛋白变性的物质

   • 作用原理：通过与酶的必需集团结合而抑制酶的活性

     • 不可逆抑制：与酶结合紧密；通常酶的必须基团共价结合，使酶失活。一般不能用透析、超滤等方法去除。eg有机磷、重金属离子、As2O3砒霜；#沙林、气化有机磷，不可逆抑制胆碱酯酶活性；阿托品 竞争性抑制剂：
     • 可逆抑制：与酶结合不紧密：

     抑制剂种类	特征
     可逆抑制剂	非共价的，采用透析、超滤等方法可以去除
     竞争性抑制剂 competitive	抑制剂I与底物S结构类似，竞争结合活性中心；抑制程度取决于[I]与[S]比值； \(K_m\)增大，\(V_{max}\)不变 \(\frac{1}{V} = \frac{K_m}{V_{max}} * (1 + \frac{[I]}{K_I}) * \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\)
     非竞争性抑制剂 non-competitive	I与活性中心外的必需基团结合； \(K_m\)不变，\(V_{max}\)减小 \(\frac{1}{V} = \frac{K_m}{V_{max}} * (1 + \frac{[I]}{K_I}) * \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}} * (1 + \frac{[I]}{K_I})\)
     反竞争性结合 ubcompetitive	I与酶-底物复合物结合，不与游离酶结合； \(K_m\)减小，\(V_{max}\)减小

     • 竞争性抑制剂：
     • 丙二酸：琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
     • 磺胺类药物抗菌机理
     • 氨甲喋呤 (methotrexate, MTX)（核苷酸代谢）

4. 酶的调节 regulation

酶的活性调节（别构调节allosteric regulation、化学修饰chemical modification）：对酶促反应速率的快速调节

• 别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象改变，进而改变酶活性状态的现象
• 别构酶；别构调节物modulator（激活剂/抑制剂）
  • 糖原合酶：ATP别构激活剂；AMP别构抑制剂
• 意义：快速调节酶的活性，是代谢调节的重要方式
• 化学修饰：酶分子中某些氨基酸残基经酶促反应发生可逆的共价修饰，从而引起酶活性改变的过程，又称共价修饰
• 酶原zymogen的激活：在细胞内合成或初分泌是没有活性的酶的前体分子、由无活性酶原转变为有活性酶的过程
• 机制：酶原分子去除一个活多个太短，是的分子构象发生改变，从而暴露或形成酶的活性中心。

酶的含量调节（合成和降解）：对酶促反应速率的缓慢调节(Proteasome特异性/Lysosome非特异性)

酶原存在及激活的意义：产生/分泌部位与作用部位不同，让酶在适当的场所、适当的时间被激活

5. 酶在医学中的应用

酶和疾病的关系：

• 某些疾病的发生与酶的缺乏或异常有关：苯丙酮尿症、苯丙氨酸羟化酶缺陷；白化病、缺酪氨酸酶；蚕豆病、葡糖-6-磷酸脱氢酶
• 酶可用于某些疾病的诊断：通过测定血清酶的活性可以辅助诊断疾病、观察预后
• 酶也用于某些疾病的治疗：助消化、溶解血栓

酶与医学研究的：

• 疾病发生的机制
• 疾病治疗的靶点

医学研究的工具